Un schéma très efficace pour la préparation de bibliothèques à partir d'un seul

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 13913 (2023) Citer cet article

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Bien que les méthodes de séquençage de la préparation de banques à partir d’ADN double brin soient bien établies, celles à partir d’ADN simple brin (ADNsb) n’ont pas été bien étudiées. De plus, les méthodes existantes présentent des limites en termes d'efficacité et de rendement. Par conséquent, nous avons développé une procédure très efficace pour la préparation de bibliothèques de séquençage à partir d’ADNsb. Dans cette méthode, le premier marquage par adaptateur de l’ADNsb est effectué à l’aide de la ligature de l’ADNss à médiation par le connecteur adénylate (TACS) assistée par la désoxyribonucléotidyl transférase terminale (TdT), que nous avons rapportée récemment. Après la synthèse du brin complémentaire à l'aide de l'ADNsb marqué par l'adaptateur, un deuxième marquage de l'adaptateur via la ligature de l'adaptateur basée sur la topoisomérase I du virus de la vaccine (VTopoI ou TOPO) est effectué. Avec des étapes supplémentaires pour la dégradation, la répression et l'élimination du dimère adaptateur, le schéma TACS-TOPO proposé réalise la préparation d'une bibliothèque de séquençage sans dimère adaptateur à partir d'échantillons d'ADNsb de 24 pg. Le schéma TACS-TOPO a été appliqué avec succès à l’analyse de l’ADN acellulaire avec préparation de bibliothèques sans amplification à partir de 50 µL de sérum humain. Un schéma TACS-TOPO modifié a également été appliqué à l'ADN extrait d'os humains anciens, apportant des rendements de bibliothèque deux à huit fois supérieurs à ceux utilisant un protocole de préparation de bibliothèque conventionnel. Les procédures de préparation de VTopoI et de son complexe avec un adaptateur oligonucléotidique double brin sont également décrites. Dans l’ensemble, le schéma TACS-TOPO proposé peut faciliter l’analyse de séquençage pratique et sensible de l’ADNsb.

Bien que de nombreuses méthodes efficaces soient disponibles pour la préparation de bibliothèques de séquençage à partir d’ADN double brin (ADNdb)1,2,3, des méthodes limitées sont rapportées pour l’ADN simple brin (ADNdb). Seuls trois principes majeurs pour la préparation de bibliothèques de séquençage à partir d’ADNsb ont été établis à ce jour. La première approche implique une queue homopolymère médiée par la désoxyribonucléotidyl transférase (TdT) terminale jusqu'à l'extrémité 3' de l'ADNsb ; la queue est ensuite utilisée comme site d'amorçage pour convertir l'ADN simple brin cible en ADN double brin, suivi du marquage du deuxième adaptateur avec l'ADN ligase T44. La préparation de bibliothèques médiée par TdT est très efficace et certains fabricants proposent des kits de préparation de bibliothèques basés sur ce principe. Cependant, une longue queue peut constituer un obstacle à l’analyse du séquençage en aval.

La deuxième méthode est basée sur la ligature de l’ADNsb catalysée par l’ARN ligase, qui relie un adaptateur 5′-phosphorylé à l’extrémité 3′ de l’ADNsb. Par exemple, le groupe de Meyer a établi une méthode basée sur la CircLigase II5,6. Après la ligature de l'adaptateur, l'ADNsb est converti en ADNdb, suivi d'un deuxième marquage de l'adaptateur par l'ADN ligase T4. Bien que l'ARN ligase puisse relier deux molécules d'ADN double brin, l'efficacité de la réaction est limitée à moins de quelques pour cent. Par conséquent, le rendement de la préparation de bibliothèques utilisant l’ARN ligase est plutôt limité.

La troisième approche utilise l’ADN ligase T4 pour la ligature de l’ADN double brin7. Un adaptateur double brin avec un hexamère aléatoire simple brin à une extrémité est utilisé dans cette méthode. Si l'hexamère aléatoire est hybridé de manière compatible avec l'extrémité de l'ADN double brin cible, l'entaille à l'extrémité partiellement double brin de l'adaptateur peut être scellée avec de l'ADN ligase T4. Cette procédure basée sur la ligature par attelle est appelée ssDNA2.0 et montre une efficacité supérieure à la méthode basée sur CircLigase II7. Bien que les méthodes basées sur l'ARN ligase et l'ADN ligase T4 puissent produire des connexions propres avec l'ADN double brin cible, leur faible efficacité dans la préparation de bibliothèques reste à résoudre.

Pour améliorer la préparation d'une bibliothèque de séquences à partir de l'ADNsb, nous avons développé une technique pour le marquage efficace de l'adaptateur de l'ADNsb, appelée ligature d'ADN simple brin (ss) (TACS) assistée par un connecteur adénylate terminal (TdT)8. Dans la ligature TACS, l'ADNsb cible est d'abord suivi de quelques adénylates à l'aide de TdT dans un processus appelé ribotailing, suivi d'un marquage d'adaptateur médié par l'ARN ligase de l'ADNsb à queue ribo. La ribotailation de l'extrémité 3′ de l'ADNsb lui permet de se comporter comme de l'ARN, ce qui améliore considérablement l'efficacité de la ligature de l'ADNsb des ARN ligases. En conséquence, la ligature TACS permet le marquage par adaptateur de plus de 80 % de l’extrémité 3′ de l’ADNsb cible8. Notamment, la réaction résiduelle du TdT avec le ribonucléotide est auto-inhibée après l’extension de 1 à 3 nucléotides9, ce qui n’entraîne qu’une interruption minime de l’analyse de séquençage en aval.